在分子分析领域，实现DNA的超灵敏检测至关重要。目前，像聚合酶链反应（PCR）这样的传统扩增技术在超灵敏DNA检测中扮演着领导角色。然而，这些技术中常见的扩增子污染可能导致假阳性。

迄今为止，已经利用CRISPR相关核酸酶（类型V和VI）的可编程切割功能，用于在复杂的真实样本中敏感检测未扩增的核酸。然而，没有额外的扩增策略，这些CRISPR/Cas传感器的pM范围灵敏度不足以满足临床应用。

在这里，我们建立了一个发夹锁（H-locker）介导的Cas12-Cas13串联生物传感系统（Cas12-13串联传感器），用于超灵敏检测DNA靶标。无需任何额外的扩增反应或设备，该系统能够检测到显著的1 aM水平（<1拷贝/μL）的DNA。

此外，该系统能够区分结直肠癌（CRC）小鼠中的癌症突变。这对于CRISPR/Cas生物传感技术来说是一个重大进步，为下一代核酸检测提供了简单、高灵敏度和用户友好的诊断方法。

图1.H-locker介导的CRISPR/Cas串联生物传感系统的示意图。

当靶向DNA结合时，激活的Cas12a RNP横向切割H-locker以释放ssRNA激活触发器，用于Cas13a RNP，导致级联信号放大。H-locker包含两部分，一个ssRNA触发器（粉红色）和一个ssDNA锁（橙色）。（关于本图例中颜色的参考，请参阅本文的网络版本。）

实验目的

本研究旨在开发一种无需扩增的高灵敏度 DNA 检测方法，克服传统 PCR 依赖扩增的局限性，同时避免扩增污染导致的假阳性。研究重点是利用Hairpin-locker (H-locker) 介导的 Cas12-Cas13 串联生物传感系统，实现对超低浓度 DNA 的检测，并应用于检测结直肠癌 (CRC) 相关突变 (PIK3CA-H1047R)。

实验方法

1. H-locker 设计与优化

• H-locker 由ssDNA 和 ssRNA 组成，在 Cas12a 识别目标 DNA 后被切割，释放 RNA 触发 Cas13a 活化，实现信号放大。

• 通过调控H-locker 的位置、长度、环结构等因素优化其稳定性和功能。

2. CRISPR/Cas12a 与 Cas13a 串联检测 DNA

• Cas12a 识别目标 DNA，激活后切割 H-locker，释放 ssRNA 触发子系统。

• Cas13a 被释放的 ssRNA 触发后，进行二次信号放大，提高检测灵敏度。

3. 生物传感器性能评估

• 灵敏度测试：检测 DNA 的最低浓度范围，确定检测下限 (LoD)。

• 特异性测试：检测单碱基突变 (PIK3CA-H1047R) 的识别能力。

• 稳定性测试：考察 H-locker 在不同实验条件下 (如血浆环境) 的稳定性。

4. 小鼠结直肠癌模型的 ctDNA 检测

采用该方法检测CRC 小鼠血浆中的PIK3CA-H1047R 突变，验证其在生物样本中的适用性。

实验结果

• 超高灵敏度：成功检测到 1 aM (10^-18 M) 级别 DNA，检测范围跨 11 个数量级 (1 aM 10 nM)。

• 无需扩增：相比 PCR 或 LAMP，检测不依赖于额外的扩增步骤。

• 特异性强：能够区分 PIK3CA-H1047R 单碱基突变，与正常序列有显著信号差异。

• 适用于生物样本：在 CRC 小鼠血浆中成功检测到 ctDNA 突变，证明临床应用潜力。

实验优点

1. 超高灵敏度 (1 aM)，无扩增即可检测超低浓度 DNA。

2. 抗污染能力强，避免 PCR 扩增导致的假阳性问题。

3. 检测时间短 (≤ 60 min)，比传统 CRISPR/Cas 反馈回路 (≥4 h) 快。

4. 适用于真实生物样本，可用于液体活检，检测 CRC 相关 ctDNA。

5. 方法简单、易用，不需要复杂设备或昂贵试剂，便于推广。

该研究提出了一种无需扩增的 CRISPR/Cas 串联检测策略，可用于癌症 ctDNA 检测、临床诊断等应用。

结论

在这项研究中，我们建立了一个由H-locker介导的Cas12-Cas13串联生物传感系统，该系统专门用于超灵敏检测DNA目标。

值得注意的是，该系统实现了一个显著的灵敏度阈值，为1阿摩尔（<1拷贝/微升），无需额外的扩增反应或特殊仪器。此外，它能够准确区分来自正常和结直肠癌（CRC）小鼠模型的血浆样本中的PIK3CA-H1047R突变。

这一突破标志着CRISPR/Cas生物传感技术的重大进步，提供了一种简化的、高灵敏度的、用户友好的下一代核酸检测方法。

作者介绍

邓博士目前是新南威尔士州癌症研究所（Cancer Institute NSW）的早期职业研究员（Early Career Fellow）。他在澳大利亚悉尼新南威尔士大学（UNSW）获得博士学位。邓博士的研究兴趣包括现场检测（point-of-care）生物传感器、CRISPR生物传感器以及体内生物传感器。

迄今为止，邓博士已发表40余篇学术论文，涵盖《Nature Communications》《Advanced Functional Materials（AFM）》《Small》《Water Research》《Brain, Behavior, and Immunity（BBI）》等国际知名期刊。此外，他已获得超过1100万澳元的研究经费资助，包括澳大利亚企业合作研究项目（CRC-P）、澳大利亚医学研究未来基金（NHMRC Ideas Grant）、澳大利亚研究理事会（ARC Discovery Project）等。

邓博士的生物传感器研究在国际上获得高度认可，曾荣获新南威尔士皇家学会（Royal Society of NSW）和ECAN的早期职业研究员奖（ECR Award），并获得多项国际会议资助。同时，他的创新技术受到了产业界的广泛关注，促成了初创公司 CasBio Pty Ltd（共同创始人）的成立，并促使他成为 Avicena Systems Limited 的研究顾问。