CRISPR/Cas系统应用模式

CRISPR/Cas系统常见的三种应用模式

1. 质粒DNA介导的基因编辑

2. mRNA介导的基因编辑

3. Cas蛋白（RNP）介导的基因编辑。

一、CRISPR/Cas系统的应用模式

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术开始崭露头角，改变了传统的基因治疗方式。对于基因编辑来说，无论是在体外还是体内，递送都是其发挥功能的第一步。目前，CRISPR基因编辑工具常以编码的质粒DNA（pDNA）、mRNA、或直接作为核糖核蛋白复合体（RNP）三种形式通过病毒（如AAV、LV）或非病毒载体（LNP、VLP等）递送到细胞中，历经不同的胞内过程，在sgRNA 的导向下，完成靶基因的编辑进而发挥作用。

如下图所示，pDNA、mRNA和RNP复合体递送至细胞后，历经不同的胞内过程，在sgRNA (单向导RNA)的导向下，完成靶基因的编辑。

图1. CRISPR/Cas系统的三种应用模式

在临床应用中，由于质粒DNA、mRNA以及RNP复合体三者本质不同，并具备不同的胞内过程，因此三者的生产难度、稳定性、起效时间、编辑效率、脱靶效应和安全性等方面也不尽相同。

1. pDNA介导的CRISPR/Cas基因编辑

研究人员发现，可以使用单个或多个质粒编码Cas9蛋白和sgRNA。质粒DNA递送至细胞后，转录形成Cas9 mRNA和sgRNA，随后Cas9 mRNA翻译成Cas9蛋白，与sgRNA形成RNP复合体，完成靶基因的编辑。质粒DNA介导的CRISPR/Cas基因编辑的优势在于质粒DNA易于构建，且生产成本低。然而，质粒DNA介导的CRISPR/Cas基因编辑存在以下风险：第一，必须选择适合Cas9和sgRNA表达的启动子以保证基因的表达；其次，Cas9蛋白需经转录和翻译途径产生，基因编辑时效会延迟；另一方面，质粒DNA介导的Cas9蛋白表达延长，可能增加脱靶效应和免疫原性，且存在质粒DNA与宿主基因组随机整合的风险。如选择质粒DNA进行基因编辑，应对其风险进行全面评估。

2. mRNA介导的CRISPR/Cas基因编辑

有研究人员尝试将Cas9 mRNA和sgRNA共同递送至靶细胞，利用mRNA介导CRISPR/Cas基因编辑。与质粒DNA相比，mRNA在细胞中的转换速度更快，限制了蛋白质的持久性，从而减少了潜在的脱靶效应。mRNA体外转录、加帽加尾、核苷酸修饰和递送系统的发展，逐步解决了mRNA稳定性、翻译效率、免疫原性等挑战。研究人员通常合成携带5’ Cap和poly(A)尾的Cas9 mRNA，增强mRNA在细胞质内的稳定性，确保有效的mRNA翻译。其次，外源性mRNA可被Toll样受体（TLRs, Toll-like receptors）识别，引发中重度免疫反应，为避免以上免疫原性，可在mRNA合成过程中耗尽尿苷或掺入假尿苷。也有研究表明，对sgRNA进行化学修饰可提高其稳定性、降低免疫原性。Cas9 mRNA与sgRNA均需借助合适的递送系统保护RNA免受降解，并辅助RNA进入靶细胞。

3. RNP介导的CRISPR/Cas基因编辑

以CRISPR/Cas9为例，RNP复合体由Cas9蛋白和sgRNA组成，通过将Cas9-gRNA RNP递送到细胞核内发挥基因编辑作用。RNP介导的CRISPR/Cas9基因编辑有以下优势：第一，Cas9-gRNA复合体可递送到多种类型的细胞，包括难以转染的细胞，如免疫细胞和干细胞，这一优势很大程度上决定了Cas9-gRNA RNP的临床治疗潜质。第二，将RNP直接递送至细胞，可以解决某些罕见真核启动子导致的蛋白质表达困难，如许多CRISPR质粒中发现的CMV或EF1A启动子，保证较高的基因编辑效率。第三，RNP的半衰期较短，限制脱靶效应的可能性。最后，Cas9 RNPs转染后很快就能检测到高水平的Cas9 RNPs，随后通过蛋白质降解途径迅速从细胞中清除。RNP介导的CRIPR/Cas基因编辑同时面临一定的挑战。首先，Cas9蛋白注入血液后易被蛋白酶降解；其次，RNP分子较大，可能限制其穿透细胞膜。可通过选择合适的递送载体解决以上难题。另一方面，生产过程中需保证Cas9蛋白纯度和活性，这是Cas9蛋白发挥基因剪刀作用的必要条件。

由于质粒DNA、mRNA和RNP复合体分子本质的不同，经过不同的胞内过程发挥作用，因此三者的设计和生产难度、稳定性、起效时间、编辑效率、脱靶效应和安全性也不尽相同，详见下表。

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