蛋白提纯是一个一个比较复杂的过程。对于新手来说，可能会遇到一些问题。

蛋白提取纯化常见问题

1、蛋白纯化标签应该如何选择？

在进行蛋白表达时，选择合适的标签有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，因此了解几种常用的蛋白纯化标签很重要。

一般来说，常用的蛋白纯化标签主要有His tag、MBP tag、GST tag、Strep tag、NusA tag等。

这些蛋白纯化标签之间有什么不同？各有什么优点缺点？

His tag（组氨酸标签）融合蛋白是目前最常见的表达方式，其优点是标签小，纯化步骤简便，纯化条件温和，能纯化可溶性/包涵体蛋白，一般不会影响蛋白的功能结构，且可以产出大量的目标蛋白，但该标签不适合易氧化蛋白或膜蛋白的纯化。

MBP tag（麦芽糖结合蛋白标签）可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。

GST tag（谷胱甘肽巯基转移酶）的洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。

Strep tag（strep标签）能产出高纯度（95%）的目标蛋白，而且可以保持目标蛋白活性，主要是因为它的纯化流程温和。其次，它能进行变性条件下的纯化。用于WB/ELISA，可侦测目标蛋白。另外，还可固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或更进一步用以筛选治疗用蛋白质，或是工业用酵素。但是，Strep tag纯化系统的价格相对His tag而言较高，所产出的目标蛋白数相对较少。

NusA tag（转录终止/抗终止蛋白标签）不具有独立的纯化标签功能，需要和其他标签（如His标签）联用，可提高蛋白质的溶解性，但由于分子量较大，对蛋白下游应用会有影响。

2、重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能一次纯化大量血清IgG吗？例如：几十毫升, 如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清 IgG，先要偶联其相应配基，如抗体或蛋白A是吗？这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么？

几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的重组蛋白A，琼脂糖凝胶 FF 就可以, 也可以分两三次纯化，这都没有问题。如果是想做血清中的抗体纯化，也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白A, 环氧活化便宜, 而且相成的键很稳定, 没有非特异吸附,是个不错的方法。

3、利用疏水性质，用反相HPLC方法分离的原理是什么？

反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反相是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点、以及样品本身的特点而改变的。

疏水的填料疏水基团密度只是反相的10%左右, 其他的都是亲水的, 而反相正好相反, 它的表面全是疏水基团，因此，疏水一般需要高盐吸附，低盐洗脱, 反相一般用甲醇水乙睛水吸附, 洗脱是逐渐增加有机溶剂的量。由于以上的原因, 疏水比反相要温和, 蛋白一般不变性, 由于填料多为琼脂糖凝胶, 所以，蛋白回收率高，而反相适合做分析比较多, 也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽, 反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因，疏水色谱是纯化蛋白的一个有力的工具。

4、通过His标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？

（1）如果纯化的是上清，蛋白酶会部分降解目标蛋白，可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

（2）可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度，以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

（3）杂蛋白和目标蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。

5、镍柱使用中出现棕色是怎么回事?

出现这样的情况，主要是缓冲液中 DTT的影响，DTT 会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被 DTT还原生成棕色的沉淀；所以，所有镍柱的生产商都强调要尽量避免 DTT 的参与，一般的镍柱耐受小于 5mM DTT，推荐缓冲液中不要超 2mM DTT。

6、镍柱堵了怎么办？

（1）柱子发生堵塞，可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致，所以样品一定要高速离心，并过0.22或者0.45的膜。

（2）上清纯化时，蛋白发生变性，有絮状物产生，尽快加入 1-2mM DTT （上清样品处理要在冰浴中进行），还不行的话，加尿素变性，使其在变性环境下。

（3）样品处理时的料液比不要太小，否则黏度大，有可能导致蛋白析出或变性，料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

7、如何处理样品，可使其初步提纯（如何洗去蛋白的自身带）？

（1）上清样品处理，要加入去污剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，还要注意温度及超声破碎的参数。

（2）去大肠杆菌自身带（两条 30KD-40KD）可用非变性缓冲液超声悬浮（加入去垢剂），离心 6000r/min，30min，10℃。（若效果不够可继续上述步骤）。

（3）大肠杆菌包涵体的洗涤，可用包涵体洗液多洗几遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可选取其中纯度最佳的。

（4）可用硫酸铵沉淀法，初步提纯。

8、没能纯化到带 His标签的蛋白，蛋白都流穿了（未挂柱）？

（1）超声的功率不对（太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放），策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。

（2）样品或者是结合缓冲液不正确 ；策略：检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。

（3）组氨酸的标签没有完全的暴露 ；策略：在变性条件下，用 8M 脲，6M 盐酸胍，1%SDS，并加入 1-2mMDTT 进行纯化。

（4）His 标签丢失，可以采取一些策略：

        策略1：WB或者 anti-his的抗体检查 His是否表达，上游构建，改变 his-tag 的位（C-terminal orN-terminal），必要时增加 his 个数（常用 6-10 个）；

        策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间；

        策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。

Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数（组氨酸）6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。

蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH，因此，一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 来筛选不同的金属离子。

9、蛋白挂在柱子上洗脱不下来，怎么解决？

（1）洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）， 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。

（2）降低 PH 的方法洗脱的，因为若 PH 低于 3.5，会导致镍离子脱落策略：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。

（3）蛋白已沉淀在柱上策略：减少上样量和孵育的时间，试用去污剂（1%-2%Tritonx-100）或改变 NaCl 的浓度，或在变性条件下洗脱（用 8M 脲，或 6M 盐酸胍），最终也可在洗脱 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。

（4）非特异性疏水或其他相互反应策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。

10、纯化过程中，蛋白出现了浑浊，怎么办？

（1）出现浑浊，说明蛋白处在不稳定的环境中、或者自身就不稳定，所以，要检查缓冲体系是否正确，环境是否低温，或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

（2）加入肌氨酸钠，迅速使蛋白变性，消除浑浊现象。

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