基于Cas13a-Cas14a的超灵敏tsRNA检测技术及其在AML预后诊断中的应用
急性髓系白血病（AML）可发生于各年龄段，在成人白血病病例中占比达80%，在儿童白血病病例中占15%-20%。该疾病患者的5年总生存率仅为25%-30%，显著低于老年人群10%-20%的5年总生存率，并且高危患者仍存在较高的复发风险。AML的诊断效果与风险分层、缓解深度监测密切相关，然而现有检测手段存在明显的时间滞后性，难以满足早期诊断与及时干预的临床需求。
近日，陆军军医大学第二附属医院血液病医学中心曹改花等人，在通信作者张曦教授的指导下，于《Chemical Engineering Journal》期刊发表了题为“Ultrasensitive detection of tsRNA through a transcleavage cross-linking Cas13-Cas14a tool”的原创性研究成果。该团队依托CRISPR/Cas13a与Cas14a系统的高特异性和高灵敏度特性，结合核酸酶P1（Nuclease P1），成功构建出无需扩增的tsRNA双信号检测技术，可直接应用于AML的预后诊断。
已有前期研究表明，tsRNA作为一类新型生物标志物，在AML的发生发展进程中发挥关键调控作用，且对疾病的诊断与预后评估具有重要的指示意义。因此，建立一套快速、精准且特异的tsRNA检测方法，对于AML预后诊断领域具有重要的潜在应用价值。研究中，Nuclease P1与DNA探针结合后，可特异性富集功能相近但长度不同的tsRNA，同时降解其他无关RNA，为tsRNA的特异性全面检测提供了基础。此外，研究人员通过系统探究CRISPR/Cas13a与Cas14a系统的性能，发现二者可借助反式切割活性构建级联信号放大体系，进而形成无扩增的超灵敏检测技术。最终，团队将Nuclease P1系统与Cas13a/Cas14a双系统有机整合，搭建了“NPCC”tsRNA检测平台。
“NPCC”tsRNA检测平台原理图
优化后的检测方法经实验验证显示，其可检测到低至1.82 fM的tsRNA，以及含量仅为0.16%的tsRNA与tRNA混合物，灵敏度较传统检测技术提升10³-10⁹倍，同时在检测耗时、成本控制等方面具备显著优势。该方法不仅特异性强、抗干扰能力优异，且不会与其他类型RNA发生交叉反应。在20例临床样本的验证中，该方法可通过检测tsRNA丰度，清晰区分健康志愿者、AML完全缓解（AML-CR）患者与AML无缓解（AML-NR）患者，为AML预后检测提供了可靠的技术支撑，也为临床医生制定后续治疗方案提供了科学依据。
综上，该团队研发的tsRNA检测方法实现了对目标分子的精准、特异、快速检测，有效突破了传统RT-PCR与RT-qPCR技术存在的非特异性扩增、浓度覆盖不足等局限。该方法基于Nuclease P1、Cas13a、Cas14a构成的双重信号输出与三重信号放大体系，可有效规避漏检、误检问题。NPCC技术能够准确区分AML患者的完全缓解与无缓解状态，具备良好的临床诊断应用前景。