低丰度非核酸生物标志物（如生长因子）是监控疾病进展、评估运动员生理状态及兴奋剂检测的关键指标。近年来，CRISPR/Cas12a系统因其特异性的反式切割活性成为生物传感领域的研究热点，但其在非核酸检测应用中仍存在局限：一是蛋白质无法直接激活Cas12a酶活性；二是常用的线性DNA探针被切割后缺乏后续放大机制，导致检测限难以突破；三是复杂样本中的预放大过程极易引入非特异性信号。

近期，上海体育大学兴奋剂检测研究院邓晓军教授课题组整合了CRISPR/Cas12a驱动的发夹反式剪切与催化发夹组装（CHA）技术，构建了一种具备双级信号放大能力的超灵敏表面增强拉曼散射（SERS）适体传感器。该策略通过将Cas12a的精准识别能力与CHA的级联放大效应有机结合，为生物标志物分析提供了全新解决方案。相关成果以《Cas12a Trans-Cleavage of Hairpins Triggers a CHA Cascade for an Ultrasensitive SERS Aptasensor》为题，发表于ACS Sensors（DOI：10.1021/acssensors.6c00041）。

（1）Cas-CHA SERS适配体传感器的设计与构建

研究团队构建了一种基于Cas12a反式剪切底物，触发CHA级联反应的SERS适配体传感平台。通过设计了一种富含胸腺嘧啶（dT5）的DNA/RNA嵌合发夹（TR）作为Cas12a的底物。当目标蛋白成纤维细胞生长因子2（FGF2）通过适体识别触发引发链释放并激活Cas12a后，Cas12a切割嵌合发夹产生的片段可直接作为引发剂开启下游的CHA循环，实现了酶促切割+核酸电路的双重放大。并通过构建花状AuNF@4-MBA@Ag纳米探针，形成丰富“热点”，显著增强拉曼信号输出。

图1. Cas-CHA SERS适配体传感器工作原理示意图

（2）SERS标签的构建与表征

研究团队设计并合成了花状金纳米颗粒包覆银壳层的核壳结构作为SERS标签（AuNF@4-MBA@Ag）。表征结果显示，金纳米花（AuNF）提供了丰富的尖端分枝，与银壳层共同形成了大量的电磁增强“热点”；拉曼分子4-MBA被嵌入在金核与银壳之间，有效避免了复杂环境对信号分子的干扰。电镜（TEM/SEM）等图像证实了标签形貌的一致性与粒径的均匀分布，紫外-可见吸收光谱及拉曼光谱测试则进一步验证了其卓越的光学性能和高度的信号稳定性。

图2. SERS探针（AuNF@4-MBA@Ag@H2）的表征结果

（3）Cas12a-CHA SERS适配体传感器的设计与可行性分析

实验通过凝胶电泳，荧光，拉曼光谱系统地验证了检测平台的可行性。凝胶电泳结果清晰显示，仅在目标物存在时才能观察到Cas12a对发夹底物的切割条带以及后续CHA反应生成的产物条带。同时，SERS光谱结果发现，只有所有组分都存在时，显示出较强的拉曼特征峰，而在缺失目标蛋白或关键酶组分的对照组中几乎检测不到信号，充分证明了该级联放大系统在分子水平上的精准运行。

图3. 以FGF2为代表性非核酸生物标志物的Cas12a-CHA SERS适配体传感器的设计验证和可行性评估

（4）Cas12a-CHA SERS适配体传感器的性能分析

受益于级联放大效应与高性能花状纳米探针的结合，该传感器对FGF2的LOD低至1.97 × 10⁻¹⁷ g/mL。这一灵敏度相较于传统的夹心法免疫分析提高了近20,000倍，且具有较宽的线性动态范围。

此外，得益于适体的高特异性和磁分离技术对背景噪音的抑制，该平台在含有多种干扰蛋白的复杂血清样本中仍能保持优异的选择性和重现性。实际样品加标回收实验的成功，进一步证明了该方法在临床低丰度生物标志物超灵敏检测中的巨大应用潜力。

图4. Cas-CHA SERS适配体传感器的灵敏度和特异性

该研究通过巧妙设计DNA嵌合发夹，建立了Cas12a激活与熵驱动DNA电路之间的直接桥梁，不仅显著提升了检测灵敏度，还通过磁分离技术有效降低了背景噪音。这种可编程的检测平台具有高度的通用性，只需更换适体即可实现对多种低丰度非核酸生物标志物的超灵敏检测，为生物医学研究、早期疾病诊断及液体活检提供了全新的技术手段。