液体活检技术对循环肿瘤 DNA（ctDNA）中单碱基突变的检测，在胰腺癌早期诊断中具有重要意义。CRISPR-Cas系统凭借其强大的核酸酶活性、极强的信号扩增能力以及更高的检测灵敏度，在液体活检领域受到了广泛关注。然而，目前仍缺乏一种基于CRISPR-Cas的单碱基突变检测方法，使其兼具高灵敏度、高特异性，同时操作简便、实用性强。本研究通过引入阻断RNA与阻断DNA，创新性设计了一种双阻断体集成型 CRISPR-Cas14a（DBIC）系统。该系统可显著提升碱基错配的区分效率。理论分析与实验验证均证实，本方法的检测限低至0.0005%，完全满足癌症早期筛查的需求。在实际临床样本检测中，利用DBIC系统成功实现了胰腺癌3个高频热点突变位点的鉴定，并通过与高通量测序（NGS）结果比对验证了其有效性。该系统操作简便、成本低廉且检测限极低，在临床广泛应用方面展现出巨大潜力。

本研究构建的DBIC系统充分利用了CRISPR-Cas14a强大的核酸酶活性以及四链置换反应所带来的优势。首先，我们引入一条与单向导 RNA（sgRNA）完全互补的阻断RNA（BLK‑RNA），再引入一条与野生型（WT）序列完全互补的阻断DNA（BLK‑DNA）。在四链置换过程中，当突变型（MT）作为靶链激活Cas14a时，碱基错配数恒定为1；而当野生型（WT）作为靶链时，错配数则从0变为2。理论与实验验证结果均表明，相较于传统方法，该设计可引发热力学差异与信号放大效应，从而显著提升CRISPR-Cas14a系统对单碱基错配的识别区分因子（DF）。

图1. (A)DBIC系统示意图；(B)常规体系实时荧光信号曲线；(C)BLK‑RNA体系实时荧光信号曲线；(D)BLK‑DNA体系实时荧光信号曲线；(E)DBIC体系实时荧光信号曲线；(F)不同检测体系所采用的底物；(G)不同检测体系对单碱基错配的区分因子（DF）。所有实验均重复3次。

随后，我们通过调整错配位点、BLK‑RNA长度及BLK‑DNA长度对区分因子进行了优化。最终，DBIC系统对突变丰度的检测限（LOD）低至 0.0005%。在临床样本检测中，DBIC系统检测结果与二代测序（NGS）结果高度一致，表明该系统完全能够满足临床检测需求。

图2. (A)常规体系中不同错配位点示意图；(B)不同错配位点的实时荧光信号速率图；(C)错配位点位于8nt、12nt、13nt、14nt 和 16nt 时的实时荧光信号曲线；(D)不同错配位点的区分因子（DF）；(E)BLK‑RNA体系中不同长度阻断RNA（BLK‑RNA）示意图；(F)不同错配位点与不同长度BLK‑RNA组合的区分因子（DF）；(G)经校正的完全匹配靶链激活CRISPR-Cas14a的实时荧光信号速率图；(H)8nt错配位点的实时荧光信号速率图；(I)12nt错配位点的实时荧光信号速率图；(J)13nt错配位点的实时荧光信号速率图；(K)14nt错配位点的实时荧光信号速率图；(L)16nt错配位点的实时荧光信号速率图。

图3. (A)BLK‑DNA体系中不同长度阻断DNA（BLK‑DNA）示意图；(B)不同错配位点与不同长度BLK‑DNA组合的区分因子（DF）；(C)DBIC体系中不同BLK‑RNA与不同BLK‑DNA组合示意图；(D)错配位点位于13nt时优配组合的区分因子（DF）；(E)优配组合与短链组合的筛选示意图；(F) 错配位点位于13nt时短链组合的实时荧光信号曲线；(G)短链组合的区分因子（DF）。

与现有高灵敏度突变检测技术相比，DBIC系统具有显著优势。数字PCR虽灵敏度高，可检测低至 0.005% 的低频突变，但存在成本高、操作繁琐等局限。与之相对，DBIC系统不仅实现了更低的检测限，还大幅降低了检测成本。相较于基于CRISPR-Cas12a的检测平台（如 DETECTR和HOLMES），DBIC系统具备更优异的检测特异性。在相同序列条件下，我们进一步将Cas14a与Cas12a分别结合DBIC系统对KRAS G12D位点进行对比检测，结果证实 Cas14a 赋予系统显著更优的突变区分能力。