尽管Cas12f（Cas14）属于最小的第2类 CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）效应因子之一，但它会与引导RNA组装成二聚体核糖核蛋白（RNP）复合物，这显著增加了其功能尺寸，从而限制了其在基因编辑和生物传感应用中的适用性。为克服这一局限，我们通过结合计算建模与实验验证，系统研究了Cas12f二聚化的结构与功能作用。利用蛋白质数据库数据和AlphaFold-3预测进行的结构分析表明，tracrRNA的5’末端序列对二聚体形成至关重要，但对底物切割并非必需。基于此，新南威尔士大学等机构基于AlphaFold3指导的tracrRNA重新设计产生了小型单体Cas12f核糖核蛋白复合物（RNPs）。这种功能性单体 RNP 表现出显著增强的跨链切割活性：对单链DNA提高4.5倍，对双链DNA提高3.5倍，对RNA提高2.5倍；同时检测灵敏度也大幅提升：对单链DNA和双链DNA提高10倍，对RNA提高4倍。此外，该功能性单体 RNP 展现出与二聚体 RNP 相当的顺式切割活性和基因编辑效率，从而恢复了Cas12f作为紧凑型酶在体内基因编辑中的优势。这些结果表明，功能上呈单体结构的Cas12f RNP 在保持其独特紧凑尺寸的同时，兼具卓越的生物传感性能，这对基因编辑应用具有显著优势。

结构模拟：使用AlphaFold 3 (AF3)服务器对Cas12f RNP结构进行模拟。利用PyMOL软件进行结构比较，计算均方根偏差（RMSD）。

反式切割活性评估： 比较了使用截短和全长tracrRNA的Cas12f RNP对ssDNA、dsDNA和RNA靶标的反式切割活性。反应体系包含Cas12f、tracrRNA、crRNA和荧光报告分子（Texas Red-18T-BHQ2），通过荧光强度变化评估活性。

检测限（LOD）测试：通过测试不同浓度的靶标核酸，计算信背比（S/B > 3）来确定LOD。

特异性测试： 使用含有单核苷酸多态性（SNP）的靶标评估系统的区分能力。

体外转染效率测定： 在MDA-MB-231-GFP细胞系中评估Cas12f RNP对GFP基因的敲除效率（顺式切割活性），使用流式细胞术和共聚焦显微镜检测。

带有截断和全长 tracrRNA 的 Cas12f 结构模拟

鉴于在无靶 DNA 存在时，Cas12f 的活性位点（包括来自 RuvC 的 D326、E422 和 D510，以及来自 Nuc 的 R490）被盖子基序 （L424-F442）遮挡，而在靶 DNA 存在时变得可接近 [15]，我们分 析了靶标结合诱导的结构变化。具体而言，我们测量了活性位点 中的 R490 与盖子中的 S433 之间的距离，以评估活性口袋的开放程度及其对切割活性的影响，因为活性位点中的 R490 和盖子中的 S433 均位于催化口袋的边缘。不出所料，在靶 DNA 存在时，Cas12f.1 中的距离从 10.15 A（7L48，非活性的 Cas12f RNP）增 加到 17.11 A（7L49，活性的 Cas12f RNP），而 Cas12f.2 则没有显著变化（补充图 S1）。这与 Cas12f.1 而非 Cas12f.2 负责底物切割的发现相一致 [15]。结构分析表明，tracrRNA 的 5′-端序列主要与 Cas12f.2 结合，而 Cas12f.2 不参与底物切割（补充图 S2）。 基于这一发现，我们假设该序列对于二聚体形成是必需的，但对于切割活性则不是必需的。

Cas12f 功能性单体 RNP 与二聚体 RNP 在生物传感应用中的比较

为了确定 Cas12f RNP 的最佳反应条件，我们系统地评估了基础反式切割反应参数，发现最佳缓冲液为 rCutSmart，最佳温度为 46℃，报告分子为 18T ssDNA（补充图 S3）。在最佳反应条件下，我们比较了带有截断（单体）和全长 tracrRNA（二聚体）的 Cas12f RNP 的跨切割活性。结果表明，无论是由靶 ssDNA （4.5 倍）（图3A）、RNA（2.5 倍）（图3B）还是 dsDNA（有或无PAM）（2.6-3.5 倍）（图3C 和 D）触发，Cas12f 功能性单体 RNP 的跨切割活性均优于二聚体 RNA。

基因编辑应用中功能性单体与二聚体 Cas12f RNP 的比较

为了比较功能性单体和二聚体 Cas12f RNP 系统之间的相对编辑性能，我们在 GFP 阳性细胞系中进行了 GFP 破坏分析（补充图 S5A）。首先，将 Cas9 作为阳性对照，其编辑效率高于 Cas12f， 这与之前的报道一致。这证实了报告系统具有功能性，能够检测 到编辑活性（补充图 S5B 和 C）。转染后 72 小时进行的流式细胞 术和共聚焦显微镜观察显示，功能性单体和二聚体 Cas12f RNP 在 GFP 阳性细胞中的减少量相似。这些观察结果在两种细胞系 中均一致，表明在测试条件下，功能性单体 Cas12f RNP 保持了与二聚体系统相当的编辑能力（补充图 S5B 和 C）。

生化和细胞实验证实，这种功能性单体Cas12f不仅保留了完整的顺式切割活性，还表现出更高的反式切割效率（补充表S3）。一方面，通过去除功能失活的亚基，该单体系统确保反应中所有Cas12f蛋白均直接参与靶标处理，从而提升催化性能并最大化蛋白质利用率；另一方面，当引导tracrRNA被截短后，Cas12f RNP 从二聚体形式转变为单体形式，这可能改善活性位点的可及性，或改变溶液中 RNP 的动态分布。

这些改进对基于 CRISPR 的生物传感技术具有重要的技术意义。增强的跨切割活性通过放大信号输出实现了对核酸的更灵敏检测，这对于低拷贝靶标分析尤其有价值。功能性单体 RNP 还表现出广泛的兼容性，适用于多种条件，包括环境温度和多种核酸底物（单链 DNA、双链 DNA、RNA），这有助于其集成到等温扩增工作流程或无扩增诊断格式中 。这种灵活性，结合其简约的设计，使功能性单体 Cas12f 成为开发便携式和可扩展生物传感平台的多功能且高效的传感元件。