如何利用CRISPR技术进行基因敲除

在构建基因敲除时，CRISPR是最简便、成本最低且速度最快的基因编辑技术。美格君在这里为大家介绍一个全面的、分步骤的教程，来帮助大家设计首个CRISPR基因敲除实验。本系列将涵盖以下内容：

- 规划CRISPR基因敲除实验

- 设计靶向目标基因的向导RNA (gRNA)

- 合成所需的gRNA

- 将gRNA和Cas9递送到目标细胞中

- 利用CRISPR生成基因敲除

什么是CPRISPR基因敲除
CRISPR实现基因敲除的原理

在深入实验细节之前，让我们先回顾一下CRISPR的工作原理：

CRISPR系统由向导RNA (gRNA) 和DNA内切酶（如Cas9）组成。gRNA决定了基因敲除的位置。这些敲除通常被称为插入或缺失（统称为indels）。一旦gRNA和Cas9在细胞中表达，gRNA会引导Cas9结合到靶序列上并引发双链断裂。随后，细胞会通过非同源末端连接（NHEJ）或同源介导修复（HDR）的方式修复断裂。

非同源末端连接 (NHEJ) 是最活跃的修复机制，但往往不够精确，可能会导致基因编码中的突变或indels。如果indel发生在开放阅读框内，这种遗传物质的插入或缺失在转录时会导致基因失去功能。这种情况即被称为“基因敲除”。您可以使用错配切割检测来确定哪些细胞在感兴趣的基因位点含有这些indels。利用细胞的不完美修复机制，CRISPR使您能够简单地构建出您所选择的基因组区域中的敲除细胞系。

图1. CRISPR基因敲除的机制 magigen.com

接下来我们将详细介绍每一步的操作流程和技术要点，帮助您成功完成CRISPR基因敲除实验。

CRISPR基因敲除的流程和技术要点

在开始之前，你需要确定：

选择哪个细胞系：你的细胞系是否难以转染（例如Jurkat细胞、原代细胞系）或是处于终末分化状态（例如神经元、肝细胞）？在这种情况下，你可能使用病毒载体比化学转染能获得更高的递送效率。然而，病毒生产可能比较困难且耗时。如果你是初次尝试该协议，可能需要一个月的时间来优化程序。
选择哪种核酸内切酶：Magigen Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) 是基因工程中最常用的Cas蛋白。但是，你仍然可能需要考虑其他变体，如果：
- 你想使用AAV递送CRISPR：AAV的最大载荷大小约为4.5 kb，而仅SpCas9本身就有4.2 kb。如果你需要在CRISPR系统中添加调控元件或筛选标记，则较小的Cas9，如 Magigen Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) 或 Magigen Streptococcus thermophilus Cas9 (St1Cas9)，可能更适合你。
- 你的靶基因组区域没有SpCas9的前导序列相邻基序 (PAM) 序列，5′-NGG-3′：靶序列必须紧邻PAM序列才能保证Cas9的成功结合。
- 还有其他具有不同PAM序列的Cas9变体（见表1）。如果你的靶序列富含AT碱基，Cpf1，另一种RNA引导的DNA内切酶，可能是你的良好选择。
- 你需要进一步减少不必要的脱靶突变：研究人员已经对SpCas9进行了修饰以提高其特异性；例子包括SpCas9 D1135E、eSpCas9和SpCas9-HF1。这些变体相对较新，不如野生型SpCas9那样广泛使用。但是支持它们的研究基础是可靠的。它们值得一试。

名称	编号	规格	优惠价格
CRISPR/Cas12蛋白 \| AapCas12b蛋白 1000	C006M	1000pmol/盒	￥5980.00
CRISPR/Cas12蛋白 \| AapCas12b蛋白 100	C006S	100pmol/盒	￥1480.00
LbaCas12a蛋白 (Cpf1) 2000	C001M	2000 pmol	￥2799.00
LbaCas12a蛋白 (Cpf1) 70	C001S	70 pmol	￥580.00
CRISPR/Cas13蛋白 \| LwCas13a蛋白 100	C005S	100pmol/盒	￥1280.00
CRISPR Cas13蛋白 \| LwCas13蛋白 1000	C005M	1000pmol/盒	￥4999.00
CRISPR Cas14蛋白 \| Cas14a蛋白 100	C015S	100 pmol	￥1280.00
CRISPR Cas14蛋白 \| Cas14a蛋白 1000	C015M	1000 pmol	￥4999.00
CRISPR Cas9蛋白 \| spCas9蛋白 70	C002S	70pmol/盒	￥489.00
CRISPR Cas9蛋白 \| spCas9蛋白 400	C002M	400pmol/盒	￥1299.00
CRISPR Cas9蛋白 \| spCas9蛋白 2000	C002L	2000pmol/盒	￥4999.00
CRISPR Cas9蛋白 \| SPCas9-NG蛋白 70	C003S	70pmol/盒	￥539.00
CRISPR Cas9蛋白 \| SPCas9-NG蛋白 400	C003M	400pmol/盒	￥1429.00
CRISPR Cas9蛋白 \| SPCas9蛋白-NG 2000	C003L	2000pmol/盒	￥5499.00
CRISPR Cas9蛋白 \| spRYCas9蛋白 70	C004S	70pmol/盒	￥539.00
CRISPR Cas9蛋白 \| spRYCas9蛋白 2000	C004M	2000pmol/盒	￥5499.00
T7内切酶 \| T7核酸内切酶 Endonuclease I250	C007S	250U/盒	￥549.00
T7内切酶 \| T7核酸内切酶 Endonuclease I 6250	C007L	6250U/盒	￥8999.00
T7核酸内切酶 \| T7 Endonuclease I 1250	C007M	1250U/盒	￥2199.00

表1. 常用CRISPR/Cas9蛋白及其相关产品

接下来做什么？

好的。现在你已经决定了实验中使用的细胞系和Cas9。在下一篇文章中，我们将展示如何设计你的gRNAs。

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