RT-PCR/分子诊断常用酶

逆转录过程和逆转录病毒的逆转录

➢什么是逆转录？

逆转录，英文是reverse-transcription，是逆转录酶用RNA模板生成互补DNA (cDNA)的过程。

逆转录的概念最初不被接受，因为它与分子生物学的中心教义相矛盾，即DNA被转录成RNA，然后被翻译成蛋白质。然而，1970年，当科学家Howard Temin和David Baltimore发现了负责逆转录的酶，即逆转录酶时，遗传信息以这种方式传递的可能性终于被接受了。

➢逆转录酶种类

目前通过深入研究的逆转录酶包含：

▸ 莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶MMLV，它是单个75kDa单体；

▸ 禽骨髓母细胞增多症病毒的AMV逆转录酶，它有两个亚基，一个63kDa亚基和一个95kDa亚基；

▸ 人类免疫缺陷病毒1型的HIV-1逆转录酶，PDB：1HMV，它具有两个分子量分别为66和51kDa的亚基；

▸ 维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶

➢逆转录酶在病毒中的作用

逆转录酶由逆转录病毒编码和使用，逆转录病毒在复制过程中使用这种酶。逆转录病毒等逆转录RNA病毒利用RT酶将其RNA基因组逆转录成DNA，然后将其整合到宿主基因组中，并与之一起复制。反转录DNA病毒，如嗜肝病毒，可以使RNA作为组装和制造DNA链的模板。艾滋病病毒通过使用RT酶感染人类。如果没有逆转录酶，病毒基因组将无法整合到宿主细胞中，导致复制失败。

➢逆转录过程

逆转录酶从RNA模板中产生单链DNA。

图1. 逆转录酶反应示意图                       (美格生物提供)

在逆转录酶缺乏DNA聚合酶活性的病毒物种中，双链DNA的产生可能通过宿主编码的DNA聚合酶δ来完成，它将病毒DNA-RNA误认为引物，并通过使用与引物去除类似的机制，即用新合成的DNA取代原始RNA模板，合成双链DNA。

逆转录过程极易出错，正是在这一步骤中可能发生突变。这种突变可能会引起耐药性。

➢逆转录病毒的逆转录过程

逆转录病毒，也称为VI类ssRNA-RT病毒，是具有DNA中间体的RNA逆转录病毒。它们的基因组由两个带5’帽和3’聚腺苷酸尾部的正单链RNA分子组成。逆转录病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒（HIV）和人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）。在胞质溶胶中，双链DNA的产生以一系列步骤进行：

1、一种特定的细胞tRNA充当引物，并与病毒RNA基因组的互补部分杂交，该互补部分称为引物结合位点或PBS。

2、然后，互补DNA与病毒RNA的U5（非编码区）和R区（在RNA分子两端发现的直接重复序列）结合。

3、逆转录酶上一个称为RNAse H的结构域降解RNA的5'端，从而去除U5和R区。

4、然后，引物“跳”到病毒基因组的3'端，新合成的DNA链与RNA上的互补R区杂交。

5、第一链互补DNA（cDNA）被延伸，大部分病毒RNA被RNAse H降解。

6、一旦链完成，就从病毒RNA开始第二链合成。

7、然后是另一个“跳跃”，来自第二链的PBS与第一链上的互补PBS杂交。

8、这两条链都进一步延伸，并可以通过整合酶整合到宿主基因组中。

图2. 逆转录病毒的逆转录过程                                 (美格生物提供)

双链DNA的产生还涉及链转移，在链转移中，短DNA产物从最初的RNA依赖性DNA合成转移到基因组另一端的受体模板区域，随后，逆转录酶到达这些区域，利用其DNA依赖性DNA活性进行处理。

逆转录病毒核糖核酸排列在5'末端至3'末端。引物与病毒RNA退火的位点被称为引物结合位点（PBS）。连接到PBS位点的RNA5’端被称为U5，连接到PBS的RNA3’端被称作前导。tRNA引物在14至22个核苷酸之间展开，并在PBS中与病毒RNA形成碱基配对的双链体。PBS位于病毒RNA的5'末端附近这一事实是不寻常的，因为逆转录酶从引物的3'末端沿5'到3'方向（相对于RNA模板）合成DNA。因此，引物和逆转录酶必须重新定位到病毒RNA的3'端。为了完成这种重新定位，需要多个步骤和各种酶，包括DNA聚合酶、核糖核酸酶H（RNase H）和多核苷酸解链。

HIV逆转录酶还具有在cDNA合成过程中降解病毒RNA的核糖核酸酶活性，以及将有义cDNA链复制到反义DNA中以形成双链病毒DNA中间体（vDNA）的DNA依赖性DNA聚合酶活性。

➢真核生物的逆转录过程

利用逆转录酶，称为逆转录转座子的真核生物基因组的自我复制片段通过RNA中间体从基因组中的一个位置移动到另一个位置。它们大量存在于动植物的基因组中。端粒酶是在包括人类在内的许多真核生物中发现的另一种逆转录酶，它携带自己的RNA模板；该RNA用作DNA复制的模板。

➢原核生物的逆转录过程

原核生物中逆转录酶的初步报道早在1971年就有了。此后，这些被广泛描述为细菌逆转录酶的一部分，细菌逆转录酶是编码逆转录酶的不同序列，并用于合成msDNA。为了启动DNA的合成，需要引物。在细菌中，引物是在复制过程中合成的。

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