逆转录环介导等温扩增LAMP技术检测H3亚型猪流感病毒
猪流感检测
分子检测-LAMP扩增法检测猪流感
猪流感跟非洲猪瘟不一样。猪流感 (Swine influenza，SI) 病原为正黏病毒科、A型流感病毒属的（甲型）流感病毒。猪流感被认为是“猪呼吸道病综合征”的原发病之一，也是集约化养猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道疾病之 猪感染猪流感病毒（SIV）后会导致其他疾病如猪蓝耳病、猪圆环病毒病和猪胸膜肺炎等疾病的发生，从而给养猪业造成巨大的经济损失。更重要的是，猪体可以同时感染不同种、不同亚型的流感病毒。因此，许多学者认为猪在流感病毒大流行的产生中起着重要作用，它是人与猪流感病毒间发生基因重组的重要场所，是人流感病毒和猪流感病毒的 “搅拌器”，对人类健康也造成了严重的威胁，而快速诊断和及时监测是控制猪流感的前提条件。
猪流感呈地方性流行，世界性分布，可发生于各年龄和各品种猪，发病率高达100％。目前己发现 SIV至少有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、 H4N6和H9N2等7种不同血清业型，其中广泛流行于猪群中的主要有古典型猪H1N1、类禽型 H1N1和类人型H3N2毒株。这些不同血清型的病毒都可以引起相应的免疫反应，但相互之间并不存在交叉免疫性。其中导致猪发病的主要为 H1N1、H1N2和H3N2 3种血清型的SIV。猪流感还是猪免疫抑制性疾病之一，在规模化养猪场中普遍存在，通常难以根除。因此，为了有效地加强猪流感的监测工作，急需建立一种快速、敏感、特异和方便的SIV检测技术。
由Notomi T等人设计创立并可应用于病毒检测的环介导等温扩增技术（LAMP），是一种新型核酸扩增技术，以其灵敏度高，反应迅速，特异性强而逐渐在分子生物学领域获得重视和应用。该技术依赖于能够识别靶序列6个区域的2对引物和具有链置换性的DNA聚合酶，大大提高了扩增特异性和效率。反应过程中缩短了反转录、模板变性。与扩增循环过程中温度变化所需要的时间，整个反应可在恒温状态下经过1h—2h就可完成。而且在反应过程中可产生副产物焦磷酸镁沉淀，因而还可以通过肉眼观察到反应结果。根据RT-LAMP技术原理，建立了一种检测猪流感病毒方法，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1材料
1.1.1 毒株H3业型猪流感病毒疫苗株、H3业型猪流感病毒、PCV一2、PRSSV由华南农业大学家禽免疫研究室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器
AMV反转录酶（5 U/μL、HRP RNA酶抑制剂（40 U/μL）及相应缓冲液，dNTPs（2.5 mmol/μgL each)，Hha I，DNA Marker DL 2000，Bst DNA聚合酶，RNA提取试剂Trizol Reagent，DEPC，饱和酚，氨苄青霉素，链霉素，溴化乙锭(EB），琼脂糖，Express Gradient PCR仪，水浴锅。
1. 2方法
1. 2.1 扩增引物的设计和合成
根据GenBank上公布的H3业型SIV HA基因序列，比对后选取保守区域，用Primer 5.0设计两条外引物（F3、B3）和两条内引物（FIP和BIP：引物FIP由 FIC、F2和TTTT连接子组成；引物BIP 由BIC、B2 和TTTT连接子组成）。
引物序列：
F3： 5'-GGGGCATGTCCCAAGTATG-3'
FIP: 5'-CTGCTATTGCGCCGAATATGCCTC-TTTT-GTTGGCAACAGGGATGCGG-3'
BIP：5'-TGGTTGGGAGGGAATGATAGACGG-TTTT-GCTGCTTGTCCTGTGCCCTC-3'
B3: 5'-CGATGGCTGCTTGAGTGC-3'
1. 2. 2反应条件的优化
按照Trizol Reagent RNA 提取试剂盒使用说明书中介绍的步骤，提取猪流感病毒总RNA作为模板，在PCR仪上进行扩增。反应体系（25 μL)如下：
2.5 μL 10xbuffer,
4 μL dNTPs(2.5 mmol/μL),
内引物H3 FIP/BIP(10 μmol/μL)各2L,
外引物H3 F3/B3(10μmol/μL)各0.5 μL,
1 μL Bst DNA 聚合酶(8 U/μL),
AMV 反转录酶1 μL(100 U/μL),
RNA 模板5 μL,
DEPC 处理水 6.5 μL。
1.2.3反应温度的选择
取9个相同的灭菌PCR管, 其中3个管设为阴性对照, 以等量的DEPC处理水代替RNA模板, 其余6个管作为阳性反应管, 所有管内均按上述反应体系分别添加相应的试剂和RNA模板。
密封并混匀后，42℃保温10min进行反转录, 然后分别取1个阴性对照管和2个阳性反应管在55、60、65℃3个反应温度条件下作用40min,进行扩增,以确定最佳反应温度。
l. 2．4反应时间的确定
取12个相同的火菌PCR 管，其中4个管设为阴性对照（以等量的DEPC处理水代替RNA模板），其余8个管作为阳性反应管, 所有管内均按上述反应体系分别添加相应的试剂和 RNA模板。密封并混匀后，42°'C保温10 min进行反转录，然后分别取1个阴性对照管和2个阳性反应管，在1. 2. 3确定的最适反应温度条件下，分别扩增20、30、40、60 min，最后在80°C反应10 min以终止反应，扩增产物采用20 g/L琼脂糖凝胶（含 0.5 μg/mL-的溴化乙锭）电泳检测，电泳条件为 80V、30 min。用VL凝胶成像系统观察并记录结果。
1. 2. 5 RT-LAMP的特异性试验
用H3 LAMP 引物分别对H3亚型SIV、PCV-2、PRSSV等核酸物质进行测试，以确定RT一LAMP反应的特异性。
1. 2. 6 RT-LAMP的灵敏度试验
将抽提出来的 H3业型SIV核酸产物进行10倍递进稀释至10-7， 然后进行RT-LAMP的测试，以确定其灵敏度。
1. 2. 7 酶切鉴定和可视化结果
用Hha I对H3亚型病毒RT-LAMP产物进行酶切鉴定。在20μL反应体系中加入以下组分:
10 x buffer 2μl，
Hha I酶 1μL,
H3 SIV的扩增产物 5μL,
ddH2O 12 μL,
上述反应物混匀离心后, 37℃反应4h。
反应后取5μ反应液, 用20g/L 琼脂糖凝胶 (含0.5μg/mL EB)电泳对酶切反应产物进行检测。选择一阳性管在反应前另加人4mmol/L Mg2+, 反应结束后观察阳性管与对照管的差异。
1. 2. 8 样品检测
随机取鼻拭子样品20份，用适量生理盐水洗涤拭子, 离心取上清, 加入Trizol抽提核酸, 然后用建立的RT-LAMP技术和RT-PCR方法进行检测。
RT-PCR方法用的引物为
HA1(5'-GGAACGCTAGTGAAAACA-3') / HA2(5'-CTAGAGATTATTGTCGAC-3'),
PCR反应体系为:
10 x buffer 10 μL,
dNTPs (2.5 mmol/μL) 4 μL,
HA1/HA2各1 μL,
cDNA 5 μL,
Ex Taq 1 μL,
ddH2O 78μL.
,将上述反应物混匀, 在PCR仪上按下列反应程序进行扩增:
94℃预变性 3min;
94℃ 40s, 52℃ 40s, 72℃ 90s, 30 个循环;
72 ℃延伸 10 min。
2 结果
2. 1最佳反应温度和反应时间的优化
本试验设定了55、50、6 5°C反应温度，结果发现，在这3种温度条件下均能进行LAMP反应，但是在不同温度条件下扩增产物的含量有差异。这表明Bst DNA聚合酶在不同温度下活性大小有点差别，但在55 ℃~65 ℃范围内均可发生反应。
本研究确定的最佳反应温度为65°C。以65 ℃为反应温度，选取H3亚型基因分别在20 min~60 min时间内不同时间段的LAMP反应终产物的电泳检测。
在反应20 min后，可见明显的梯状条带，反应 20 min— 60 min后梯状条带逐渐变亮，在反应60 min后，梯状条带表现最明显。因此，RT-LAMP 扩增反应的最佳时间为60 mim（图1和图2）。
图1. 不同反应温度H3 亚型 SIV RT-LAMP扩增结果
1. 阴性对照;
2~4. 分别为在 55、60、65℃条件下H3亚型基因的RT-LAMP扩增产物
M. DNA Marker Dl 2000
图2. 不同时间条件下H3亚型SIVRT-LAMP扩增结果
1. 阴性对照;
2~5. H3亚型基因在反应20、30、40、60min后的LAMP扩增结果;
M. DNA标准DL2000:
2. 2 RT-LAMP的特异性和灵敏度测定
用H3 LAMP引物分别对H3亚型SIV、PCV2、PRSSV抗原核酸物质实施RT-LAMP反应。结果显示，只有针对H3亚型的SIV才出现目的条带，其它病毒均不扩增。本试验设计的H3 LAMP引物具有高度的特异性。将抽提出来的H3业型SIV RNA产物进行10倍递进稀释至10-7，分别采用构建的RT-LAMP方法进行检测，结果表明，即使在很低拷贝的模板RNA存在时（10-7)，仍有微弱的产物带（图3和图4)。
2. 3 RT-LAMP反应产物的酶切鉴定和可视鉴别
理论计算中，H3亚型扩增终产物经内切酶 Hha I消化后，出现两条大小分别为75 bp和 140的主带以及少量其它大小不同的条带，图5. 结果与理论值完全相符。在自然光下LAMP的扩增结果，可见阳性管的反应液已明显混浊，这是因为扩增后形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀所致。
图3. RI-LAMP灵敏度试验结果
1. 阴性对照
2~7. 产物稀释至10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2倍
M. DNA Marker DL 2 000
图4. RT-LAMP特异性试验结果
1. H3亚型SIV的阳性结果
2. PCV-2
3. PRSSV
4. 阴性对照
M. DNA Marker DL 2000
2.4 样品检测
用已建立的RT-LAMP技术检测20个临床品,检测结果与病毒分离、RT-PCR方法符合率均达100%。
3 讨论
本研究建立的H3亚型猪流感病毒RT-LAMP快速检测技术具有灵敏、简便、特异性高及结果可视鉴别的优点，不仅有利于及时诊断和控制该病,而且有利于向基层兽医站和普通养殖户推广应用。由于RNA酶在环境中的广泛存在，RNA很容易降解,使得检测RNA比DNA在灵敏性上有所限制,传统RT-PCR中,反转录过程需要将近1h。
有文献证明LAMP比PCR更灵敏, 只需要很低的拷贝数就可进行扩增。所以，在RT-LAMP反应过程中，反转录的时间只设定为10min就已经足够，这进一步缩短了检测时间, 在保证高灵敏度的同时, 能够快速获得诊断结果。
RT-LAMP反应过程中有副产物焦磷酸镁沉淀的产生, 使阳性反应管有明显的变浑浊现象, 同时大量的扩增产物在结合核酸染色剂SYBR I的情况下,有肉眼可见的颜色变化 (阴性为橙黄色, 阳性偏绿色)。虽然仅靠这些判断并不准确，不能排除非特异性扩增, 但结果的可视观察, 可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制, 加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化, 在水浴锅中就能进行, 这些都使该技术在小型研究所、兽医站乃至普通养殖户均有更广阔的应用前景。
当然，LAMP的高灵敏性同时会增大反应假阳性的几率，在检测过程中要进行物理分区, 核酸抽提、核酸扩增以及产物电泳都应分别在独立的环境中进行, 因为产物电泳图为梯状拖带图样，一旦出现非特异应扩增不易察觉。所以用限制性内切酶进行鉴定就显得十分必要。
近年来, 有学者发现LAMP扩增反应所需要的Bst聚合酶对血液、细胞培养液等各种物质表现出比Tag聚合酶更高的耐受性, 对于DNA的检测来说, 核酸抽提或许能省略就能达到检测的目的，这是一个优点。
现在的LAMP扩增技术已经有了巨大的进步，成熟商业化的LAMP检测产品已经上市，例如Magigen LAMP kit, 检测时间已经小于30分钟，灵敏度已经与PCR一致，不论是科学研究还是工业化生产，效率都大大提高。
总之，RT-LAMP作为一种便捷、高特异性、高灵敏度的新型核酸扩增方法，随着方法的不断发展与改进, 必将在分子生物学特别是传染病的病原检测方面发挥重要作用。
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